Giải trình tự thế hệ tiếp theo là gì? Nghiên cứu khoa học

Giới thiệu về giải trình tự thế hệ tiếp theo

Giải trình tự thế hệ tiếp theo (Next‑Generation Sequencing, NGS) là tập hợp các công nghệ xác định trình tự nucleotide của DNA hoặc RNA theo cơ chế “siêu song song”, cho phép đọc đồng thời hàng triệu đến hàng tỷ phân tử trong một lần chạy. So với phương pháp Sanger truyền thống, NGS tạo ra sản lượng dữ liệu lớn hơn nhiều, giảm chi phí trên mỗi base và rút ngắn thời gian từ khâu chuẩn bị thư viện đến phân tích kết quả. Sự xuất hiện của NGS đã thay đổi căn bản sinh học phân tử, di truyền học và y học chính xác, mở đường cho giải trình tự hệ gen toàn bộ, giải trình tự biểu hiện gen và phân tích biến dị quy mô dân số.

Trọng tâm của NGS là năng lực ghi nhận tín hiệu hóa học/điện của phản ứng polymerase hoặc dòng ion đi qua kênh nano, chuyển chúng thành “đọc” (reads) sau quá trình giải mã tín hiệu (basecalling). Mỗi nền tảng sử dụng một cơ chế cảm biến khác nhau, nhưng đều chung mục tiêu: tăng thông lượng, đảm bảo độ chính xác, và kiểm soát sai số bằng các vòng kiểm định chất lượng. Nhiều hạ tầng phòng thí nghiệm từ nghiên cứu cơ bản đến lâm sàng đã tiêu chuẩn hóa quy trình NGS để đảm bảo tái lập kết quả trong điều kiện kiểm soát.

Ứng dụng của NGS trải dài từ phát hiện đột biến soma trong ung thư, thăm dò hệ vi sinh vật bằng metagenomics, theo dõi bùng phát dịch tễ, đến lập bản đồ biến dị di truyền người và động thực vật. Tài liệu giới thiệu tổng quát có thể tham khảo tại Genome.gov – Next‑Generation Sequencing và các nền tảng công nghệ như Illumina, Oxford Nanopore, PacBio.

• Thông lượng cao, chi phí trên mỗi base thấp, thời gian trả kết quả nhanh.
• Độ linh hoạt cao: đọc ngắn độ chính xác cao và đọc dài để giải bài toán cấu trúc.
• Khả năng mở rộng: từ panel gen mục tiêu đến hệ gen/phiên mã toàn bộ.

Nguyên tắc cơ bản

Quy trình NGS bắt đầu bằng chuẩn bị thư viện (library preparation): DNA/RNA được phân mảnh (cơ học hoặc enzym), gắn adaptor hai đầu để nhận diện và bắt giữ trên bề mặt hoặc trong hố phản ứng, và có thể gắn chỉ số (index/barcode) cho phép trộn nhiều mẫu (multiplexing). Các bước làm sạch, định lượng và kiểm tra kích thước phân mảnh giúp đảm bảo tính đồng đều và hiệu suất của phản ứng giải trình tự. Nhiều bộ kit thương mại tiêu chuẩn hóa các thao tác này nhằm giảm biến thiên giữa lô.

Khâu tạo tín hiệu phụ thuộc nền tảng. Công nghệ tổng hợp theo chu kỳ (sequencing‑by‑synthesis) ghi nhận tín hiệu huỳnh quang khi nucleotide gắn vào sợi mới tổng hợp; công nghệ đọc phân tử đơn thời gian thực ghi nhận tín hiệu enzyme trong giếng nano quang học; công nghệ nanopore đo biến đổi dòng ion khi phân tử đi qua kênh sinh học. Dữ liệu thô sau đó trải qua giải mã tín hiệu (basecalling), gán điểm chất lượng (ví dụ thang Phred), kiểm soát ô nhiễm chéo và lọc đọc chất lượng thấp.

Độ phủ (coverage) và tính đồng đều là chỉ số cốt lõi của thí nghiệm. Độ phủ kỳ vọng phụ thuộc số đọc, chiều dài đọc và kích thước bộ gen theo quan hệ:

$C \;=\; \dfrac{N \times L}{G}$

trong đó $C$ là độ phủ trung bình, $N$ là số đọc, $L$ là chiều dài đọc, và $G$ là kích thước bộ gen (hay mục tiêu bắt giữ). Ngoài độ phủ trung bình, phân phối độ phủ (uniformity) trên các vùng quan tâm quyết định độ nhạy phát hiện biến dị, đặc biệt với biến dị tần số alen thấp.

Bước	Mô tả	Kiểm soát chất lượng
Chuẩn bị thư viện	Phân mảnh, gắn adaptor, gắn chỉ số	Kiểm tra kích thước, định lượng, sạch tạp
Tạo tín hiệu	SBS/SMRT/Nanopore	Thông số máy, kiểm tra tín hiệu nền
Giải mã & lọc	Basecalling, gán Phred, lọc đọc	Ngưỡng chất lượng, loại đọc chimeric

• Multiplexing bằng index giúp tối ưu chi phí trên mỗi mẫu.
• Spike‑in chuẩn nội (phiên bản tham chiếu) hỗ trợ giám sát sai số hệ thống.

Các nền tảng công nghệ NGS

Illumina (sequencing‑by‑synthesis): tạo cụm (cluster/bridge amplification) trên bề mặt flow cell và đọc huỳnh quang theo chu kỳ. Thế mạnh là độ chính xác cao, sai số thấp có tính hệ thống, phù hợp cho đọc ngắn (thường 50–300 bp) và các ứng dụng cần độ chính xác biến dị điểm. Hệ sinh thái kit bắt giữ đích phong phú và chuẩn công nghiệp cho WES/panel mục tiêu. Xem thêm tại Illumina.

Pacific Biosciences (SMRT): ghi nhận hoạt động polymerase trong giếng nano (ZMW) theo thời gian thực để tạo đọc dài (khoảng chục kb đến hàng chục kb). Chế độ HiFi (circular consensus) đạt độ chính xác cao nhờ đọc lặp một phân tử. Thế mạnh là lắp ráp de novo, phát hiện biến đổi cấu trúc, vùng lặp phức tạp và isoform RNA. Tham khảo PacBio.

Oxford Nanopore Technologies: đo dòng ion qua kênh nanopore khi phân tử đi qua, cho phép đọc rất dài (từ chục kb đến hàng Mb) và theo thời gian thực với thiết bị đa dạng từ cầm tay đến phòng thí nghiệm. Ưu thế trong phân giải cấu trúc lớn, methylome trực tiếp, theo dõi tác nhân gây bệnh ngoài hiện trường; độ chính xác tăng đáng kể nhờ thuật toán basecalling mới. Xem Oxford Nanopore.

Nền tảng	Chiều dài đọc	Điểm mạnh	Ứng dụng tiêu biểu
Illumina	Ngắn (50–300 bp)	Độ chính xác cao, chi phí/đọc thấp	WES, panel mục tiêu, RNA‑seq, WGS độ phủ cao
PacBio (HiFi)	Dài (10–25 kb+)	Đọc dài chính xác, isoform đầy đủ	Lắp ráp de novo, SV, transcript isoform
Oxford Nanopore	Rất dài (10 kb–Mb)	Thời gian thực, phát hiện sửa đổi base	Giám sát dịch tễ, cấu trúc genome phức tạp

• Đọc ngắn tối ưu phát hiện biến dị điểm/nhỏ; đọc dài mạnh về cấu trúc và vùng lặp.
• Chiến lược “lai” kết hợp đọc ngắn và dài cải thiện lắp ráp và gọi biến dị.

Ứng dụng trong nghiên cứu y học

Y học chính xác và chẩn đoán di truyền: giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và toàn bộ vùng mã hóa (WES) hỗ trợ phát hiện biến dị germline gây bệnh hiếm, giải mã hội chứng không chẩn đoán được bằng xét nghiệm đơn gen. Các panel mục tiêu tập trung vào nhóm gen bệnh học cụ thể, rút ngắn thời gian và giảm chi phí trong thực hành lâm sàng. Tài liệu nền tảng: Genome.gov – Genomics in Clinical Practice.

Ung thư học phân tử: NGS phát hiện biến dị soma, tái sắp xếp gen, khuếch đại/khuyết đoạn và gánh nặng đột biến khối u (TMB) để hướng dẫn liệu pháp nhắm trúng đích và miễn dịch. Công nghệ sinh thiết lỏng (cfDNA) mở rộng khả năng theo dõi đáp ứng điều trị và phát hiện tối thiểu còn sót (MRD). Các chương trình như The Cancer Genome Atlas (NCI) đã chuẩn hóa nhiều giao thức phân tích.

Sinh học hệ phiên mã và biểu sinh: RNA‑seq cho phép định lượng biểu hiện gen, phát hiện isoform và hợp nhất gene (gene fusion) trong ung thư; ChIP‑seq/ATAC‑seq khảo sát điều hòa phiên mã và cấu trúc nhiễm sắc. Ở lâm sàng, RNA‑seq hỗ trợ phân loại phân tử của u và xác định mục tiêu điều trị.

• WGS/WES cho bệnh hiếm; panel mục tiêu cho quy trình chẩn đoán thường quy.
• cfDNA/ctDNA cho theo dõi động học khối u không xâm lấn.
• RNA‑seq phát hiện gene fusion và chữ ký biểu hiện liên quan tiên lượng.

Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học

NGS đã trở thành công cụ nền tảng trong sinh học hiện đại, không chỉ giới hạn trong lĩnh vực y học mà còn mở rộng sang nghiên cứu tiến hóa, sinh thái học, nông nghiệp và môi trường. Trong nghiên cứu tiến hóa, NGS cho phép tái tạo lại lịch sử di truyền của loài, giải mã nguồn gốc loài người và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Các dự án như 1000 Genomes Project đã cung cấp cơ sở dữ liệu khổng lồ về biến dị di truyền trong quần thể người, giúp hiểu rõ hơn về sự thích nghi và bệnh học di truyền.

Trong sinh thái học, NGS được sử dụng để khảo sát đa dạng sinh học ở cấp độ DNA thông qua kỹ thuật DNA barcoding và metagenomics. Phân tích các mẫu môi trường (environmental DNA – eDNA) cho phép phát hiện các loài hiếm hoặc khó nuôi cấy, từ đó mở rộng hiểu biết về quần thể và hệ sinh thái. Đây là công cụ hữu hiệu trong bảo tồn sinh học và giám sát môi trường.

Trong nông nghiệp, NGS được ứng dụng vào chọn giống cây trồng và vật nuôi, nghiên cứu khả năng chống chịu bệnh và cải thiện năng suất. Các dữ liệu hệ gen giúp xác định marker di truyền quan trọng, từ đó hỗ trợ chương trình lai tạo có định hướng. Bên cạnh đó, NGS còn được sử dụng để nghiên cứu hệ vi sinh vật đất và ảnh hưởng của chúng đến sự phát triển cây trồng.

Phân tích dữ liệu tin sinh học

Khối lượng dữ liệu NGS khổng lồ (hàng GB đến TB mỗi lần chạy) đòi hỏi các công cụ tin sinh học chuyên dụng. Quy trình phân tích cơ bản thường bao gồm bốn bước: tiền xử lý dữ liệu, căn chỉnh (mapping), gọi biến dị và phân tích thống kê. Mỗi bước có các công cụ và thuật toán đặc thù.

Tiền xử lý dữ liệu gồm loại bỏ đoạn adaptor, lọc đọc chất lượng thấp và đánh giá chất lượng dữ liệu với công cụ như FastQC. Sau đó, đọc sạch được căn chỉnh với hệ gen tham chiếu bằng các thuật toán như BWA hoặc Bowtie. Kết quả căn chỉnh lưu trữ ở định dạng BAM/SAM, sau đó xử lý với SAMtools hoặc Picard.

Bước phát hiện biến dị sử dụng phần mềm như GATK, cho phép gọi SNPs, InDels và biến đổi cấu trúc. Kết quả được lưu ở định dạng VCF (Variant Call Format), sau đó được phân tích để xác định biến dị liên quan đến bệnh hoặc các đặc điểm sinh học. Với RNA-seq, công cụ như HISAT2 và StringTie được dùng để định lượng biểu hiện gen và phân tích isoform.

• Tiền xử lý: cắt adaptor, lọc chất lượng, QC với FastQC.
• Căn chỉnh: BWA, Bowtie cho DNA; HISAT2 cho RNA.
• Phát hiện biến dị: GATK, FreeBayes, Strelka.
• Định lượng biểu hiện: StringTie, Salmon, Kallisto.

Bảng dưới đây tóm tắt một số công cụ tin sinh học phổ biến trong phân tích dữ liệu NGS:

Bước	Công cụ phổ biến	Ứng dụng chính
Tiền xử lý	FastQC, Trimmomatic	Kiểm tra chất lượng, lọc đọc kém
Căn chỉnh	BWA, Bowtie, HISAT2	Ghép đọc với hệ gen tham chiếu
Gọi biến dị	GATK, FreeBayes	Phát hiện SNP, InDel
Định lượng biểu hiện	StringTie, Kallisto	Đo biểu hiện gen, phân tích isoform

Thách thức và hạn chế

Mặc dù NGS mang lại tiềm năng lớn, công nghệ này vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Chi phí giải trình tự đã giảm mạnh nhưng vẫn còn là rào cản với nhiều phòng thí nghiệm ở các quốc gia đang phát triển. Ngoài ra, hạ tầng tính toán mạnh mẽ và lưu trữ dữ liệu lớn là yêu cầu bắt buộc để xử lý khối lượng dữ liệu NGS ngày càng tăng.

Sai số kỹ thuật cũng là một hạn chế. Ví dụ, công nghệ đọc ngắn (Illumina) khó phân giải các vùng lặp hoặc vùng GC cao, trong khi công nghệ đọc dài (Nanopore, PacBio) vẫn có tỷ lệ sai số cơ bản cao hơn mặc dù đã cải thiện đáng kể. Vấn đề chuẩn hóa quy trình từ thu mẫu, chuẩn bị thư viện, giải trình tự đến phân tích dữ liệu cũng là một thách thức để đảm bảo tính tái lập và khả năng so sánh giữa các nghiên cứu.

Về mặt đạo đức và pháp lý, NGS đặt ra câu hỏi liên quan đến bảo mật dữ liệu di truyền cá nhân, quyền riêng tư và khả năng lạm dụng dữ liệu gen. Do đó, các chính sách quản lý dữ liệu và hướng dẫn đạo đức cần phát triển song song với công nghệ.

Xu hướng phát triển

Xu hướng chính của NGS hiện nay là giảm chi phí và tăng khả năng ứng dụng lâm sàng. Nhiều công ty đang hướng tới mục tiêu giải trình tự toàn bộ hệ gen với chi phí dưới 100 USD. Công nghệ đọc dài tiếp tục được cải thiện về độ chính xác, đồng thời kết hợp đọc ngắn và dài (hybrid sequencing) để tận dụng ưu thế của cả hai phương pháp.

Kết hợp NGS với trí tuệ nhân tạo (AI) và học máy đang mở ra hướng mới trong phân tích dữ liệu. AI có thể giúp phát hiện mẫu (pattern recognition), dự đoán chức năng biến dị và giảm sai số trong quá trình gọi biến dị. Ngoài ra, NGS đang được tích hợp với các công nghệ mới như giải trình tự tế bào đơn (single-cell sequencing) và không gian (spatial transcriptomics), cho phép nghiên cứu ở mức độ chi tiết chưa từng có.

Trong y học, NGS được dự đoán sẽ trở thành một phần không thể thiếu trong y học chính xác, hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị cá thể hóa. Sự phát triển của thiết bị nhỏ gọn, di động như MinION của Oxford Nanopore mở ra triển vọng ứng dụng tại hiện trường, từ nghiên cứu môi trường đến giám sát dịch bệnh.

Kết luận

Giải trình tự thế hệ tiếp theo là một bước tiến cách mạng trong khoa học sự sống, cho phép nghiên cứu hệ gen với quy mô, độ sâu và độ chính xác chưa từng có. Công nghệ này đã và đang thay đổi cách tiếp cận trong y học, sinh học và nhiều lĩnh vực liên ngành khác. Mặc dù vẫn còn tồn tại thách thức, với sự phát triển liên tục của công nghệ và phân tích dữ liệu, NGS chắc chắn sẽ tiếp tục là động lực chính cho các phát hiện khoa học và ứng dụng thực tiễn trong thập kỷ tới.

Tài liệu tham khảo

1. Illumina - Next-Generation Sequencing
2. Oxford Nanopore Technologies
3. Pacific Biosciences (PacBio)
4. 1000 Genomes Project
5. Genome Analysis Toolkit (GATK)
6. Genome.gov - NGS Glossary
7. FastQC - Quality Control Tool